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microRNA實時定量PCR

microRNA實時定量PCR
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               microRNA實時定量PCR檢測服務
實時熒光定量PCR技術是在普通PCR反應體系中加入熒光試劑,通過儀器對擴增過程中每一個循環的熒光信號進行實時檢測從而實現對起始模板定量或定性的分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地精確定量起始模板濃度。成熟microRNA是由21-25個核苷酸組成的小RNA,由于長度太短,不能通過傳統的實時定量PCR進行檢測。本公司通過特殊設計的莖環結構的反轉錄引物,配合實時定量PCR引物及SYBR? Green熒光染料可以精確檢測微量樣品中microRNA表達水平。
本公司提供的microRNA實時定量PCR檢測服務具有以下特點:①高特異性——只對成熟MicroRNAs進行定量,而不受其前體干擾;還可以在高度同源性的microRNAs之間進行區分,在某些實驗中甚至只有一個堿基的差異都能鑒別。②快速,簡單——整個操作只需兩步,不到3個小時,即可獲得高質量的數據。③靈敏——樣品消耗少,僅需1-10ng的total RNA或同等物;如此之高的靈敏度使得研究者可以用有限的樣品做更多的實驗,比如做全套microRNAs表達譜研究。也有利于諸如干細胞,配對的人類腫瘤/健康對照等珍貴且很難獲得的樣品的節約使用。④超寬的線性范圍——可跨越7個數量級,這意味著研究者可以準確的知道所用實驗材料的每個細胞所含的目標microRNA分子多還是少(這一點很重要,因為microRNA的表達豐度在不同種類的細胞,組織以及疾病中變化范圍很大)。⑤具有很好的重復性,由不同的研究者操作時也能體現。
英拜生物為您提供microRNA 實時定量PCR技術服務,您只需要提供保存完好的組織或細胞標本,本公司專業的技術服務人員就可替您完成microRNA實時定量PCR實驗操作和數據分析,提供給您完整的實驗報告,為您節省大量的時間和精力。
英拜生物microRNA實時定量PCR技術服務流程如下:

  1. 引物設計、合成
    設計并合成目的microRNA的莖環RT引物、PCR引物。

  2. 樣品RNA抽提
    a.組織樣品:取適量(50~100mg)新鮮組織或正確保存的組織樣品,勻漿后抽提RNA。
    b.細胞樣品:取1×106~1×107細胞,吸去培養液后用TRIZOL試劑抽提RNA。

  3. RNA質量檢測
    a.紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值,獲得RNA的濃度并通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。
    b.用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度和完整性。
    注:用于microRNA實時定量PCR檢測的RNA樣品,必須高純度、完整,沒有RNase 污染(降解的樣品不能用于實時定量PCR檢測),同時提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。

  4. 逆轉錄合成cDNA
    利用莖環引物逆轉錄合成cDNA第一鏈。

  5. 實時定量PCR
    以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增(同時測定每個樣品中U6 snRNA含量作為內參以校正上樣誤差)。

  6. 分析結果、提供實驗報告
    分析實時定量PCR結果,根據標準曲線定量樣品中的目的microRNA。提供實驗報告,包括詳細的實驗方法,實時定量PCR實驗數據和圖表。

 


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