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microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗

microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗
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 microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因驗證實驗 

福利双色球基本走势图 www.gbqemm.com.cn     環狀RNA(circRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類非編碼RNA,不翻譯蛋白。但在細胞中它們能夠調控其他基因的表達變化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA結合位點,在細胞中起到miRNA海綿(miRNA sponge)的作用,進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表達水平,這一作用機制被稱為競爭性內源RNA(ceRNA)機制。因此,通過與疾病關聯的miRNA相互作用,circRNA和lncRNA在疾病中發揮著重要的調控作用。研究cirRNA、lncRNA的調控機制需要先找到與cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA,而熒光素酶報告基因實驗可以用來證明miRNA與circRNA, miRNA與lncRNA的直接相互作用。


 
英拜生物microRNA報告基因實驗流程:
1.  microRNA靶點的預測
利用Targetscan,miRanda,PicTar軟件得到目的microRNA的預測靶點序列。
2.  獲得microRNA靶點序列
根據提供的靶序列,合成兩條互補的單鏈DNA模板?;蛘?,設計引物PCR擴增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全長序列或靶標序列)。
3.  cirRNA靶序列克隆
將合成的兩條單鏈退火成雙鏈(具有粘性末端),或將PCR產物雙酶切,后連入經過同樣雙酶切的Psicheck-2載體中,連接產物轉化大腸桿菌DH5α。
4.  陽性克隆鑒定。
挑選轉化的菌落,PCR篩選含有插入片段的陽性克隆,測序驗證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.  細胞轉染準備
將psicheck-2報告基因載體、microRNA mimics或microRNA negative control共轉染293T或Hela細胞。
6.  熒光素酶檢測
報告基因載體與microRNA mimics或microRNA negative control共轉染293T或Hela細胞24-72h后,進行雙熒光素酶檢測,確定目的microRNA的靶基因。
7.  整理分析數據,得出結論。
提供有microRNA靶序列的報告基因質粒、甘油保存菌株各一支。附實驗報告,包括載體構建過程,鑒定記錄,測序報告,細胞轉染,熒光檢測。


   




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