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SNP檢測服務(SNaPsot、Taqman探針、HRM等)

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 SNP分析檢測

一、SNP定義
基因分型,也就是單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)檢測,主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。與其它分子標記相比,SNP分辨率最高也最為豐富,覆蓋基因組范圍大,遺傳上比較穩定,在人類基因組中,估計平均每1000個堿基對就有1個SNP,估計其總數可達300萬個甚至更多,是繼微衛星之后的第三代遺傳標記。SNP的分布不均勻,非轉錄序列中要多于轉錄序列,絕大多數位于蛋白的非編碼區。通常情況下是一種二等位基因的變異,多為轉換,即一種嘧啶堿基換為另一種嘧啶堿基,或一種嘌呤堿基換為另一種嘌呤堿基,轉換與顛換之比為2:1。SNP在CG序列上出現最為頻繁,而且多是C→T,因為CG中C即胞嘧啶常為甲基化的,自發脫氨后即變為胸腺嘧啶。
二、SNP主要應用領域
遺傳圖譜繪制的標記,疾病診斷和疾病易感基因的鑒別,藥物基因組學研究和新藥篩選,藥物代謝和藥物遺傳學,法醫鑒定和個體識別,群體遺傳學研究和遺傳多態性分析,物種鑒定、菌種鑒定等。
三、SNP檢測方法
1、測序法:所有SNP的檢測方法中,對待檢測片段進行直接擴增、測序是最為準確的方法,也是SNP分析的金標準。純合型SNP位點的測序峰為單一峰型,而雜合型SNP位點的測序峰為套峰(如下圖),因而很容易將其區分開來。通過直接測序方法進行SNP檢測的檢出率接近100%。該技術主要通過直接測序的方法來確定位點的基因型,這種分型方法準確性最高,但費用大。如果需要檢測的幾個SNP位點正好位于一個測序單元內(長度小于700bp),則單個位點的分型費用可顯著降低,這種分型技術不失為一種良好選擇。對于準確性要求特別高或樣本量特別?。父齷蚣甘觶┑南钅?,這種分型技術很適合。

2、PCR-RFLPSNP分型最經典的研究方法,具有最大優勢在于,不需要有特殊的儀器,檢測操作簡單,費用低廉,也適合中量樣本的檢測。缺點是需要大量人力,耗時相對較長,不適合高通量大樣本檢測。

 
3、TaqMan探針:該技術是由美國應用生物系統公司(ABI)研發的SNP分型技術,其技術原理如下:PCR反應時,加入一對兩端有不同熒光標記的MGB特異探針來識別不同的等位基因(allele1和allele2),5’端為報告熒光基團(reporter),3’端為淬滅熒光基團 (quencher)。PCR過程中,兩個探針能與正向引物和反向引物之間的互補序列特異退火結合。當探針以完整形式存在時,由于能量共振轉移,熒光基團只發出微弱熒光。特異的探針與相應的等位基因結合后,DNA聚合酶發揮5’到3’外切酶活性,把報告熒光基團切割下來,脫離3’端淬滅熒光基團的淬滅作用 (quench),從而發出熒光。兩個探針的5’端標有不同的熒光 (FAM或VIC),3’端標有MGB 淬滅基團結合體。根據檢測到的不同熒光,可以判斷相應的樣本的SNP等位基因型。

◇TaqMan? MGB探針特點
(1)探針較短(~13bp)
(2)較短探針提高鑒定的準確性
(3)小溝結合物增加了較短探針的熔點溫度(Tm)
(4)TaqMan? MGB探針對富含A/T 的序列有良好的鑒定能力
(5)該技術操作簡單快速,軟件分析結果界清晰,標出了每個樣本的基因型及熒光強度,非常直觀,特別適合少量位點大量樣本(上千個)的分型項目。下圖為軟件分析案例。


4、MultiplexSNaPshot分型技術:該技術也是由ABI開發,主要針對中等通量的SNP分型項目。在一個含有測序酶、四種熒光標記的ddNTP、緊挨多態位點5’端的不同長度延伸引物和PCR產物模板的反應體系中,引物延伸一個堿基即終止,經測序儀電泳后,根據峰的顏色可知摻入的堿基種類,從而確定該樣本的基因型,根據峰移動的膠位置確定與該延伸產物對應的SNP位點。對于PCR產物模板可通過多重PCR反應體系來獲得。利用SNaPshot檢測技術結合高通量樣品處理平臺,每天的檢測通量能夠滿足中大規?;蚍中拖钅康男枰?。整個技術的示意圖:

多個SNP位點的分型圖
 

 
單個SNP位點分型圖:
 
 
 
方法特點:
(1)分型準確  該技術也稱小測序技術,直接得到位點的堿基組成,檢測結果直觀其準確度,僅亞于直接測序。
(2)多位點同時檢測  采用多重單堿基檢測技術,每次反應可以檢測多達10個SNP位點,而RFLP及TaqMan一次僅能檢測一個。
(3)不受SNP位點多態特性限制  不管該位點是雜合,還是插入或缺失多態,都可以放在一個體系中檢測。
(4)可以檢測出受污染的樣本  如果一個樣本的分型峰譜偏離正常的分布,它可以提示樣本可能受到污染或濃度過低,而其它分型方法則不能做到那樣。

 




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