FISH原位雜交
欄目:英拜特色服務 發布時間:2019-10-12
RNA原位核酸雜交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又稱RNA原位雜交......
RNA原位核酸雜交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又稱RNA原位雜交(RNA in situ hybridization RISH)。該技術是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是:在細胞或組織結構保持不變的條件下,用標記的已知的RNA核苷酸片段,按核酸雜交中堿基配對原則,與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合(雜交),所形成的雜交體(Hybrids)經顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的RNA分子。現在探針標記技術有生物素、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素。
   microRNA原位雜交實驗流程:
  • 福利双色球基本走势图 www.gbqemm.com.cn 組織預處理:冰凍切片、石蠟切片、細胞爬片等樣本取材、固定、切片。

  • 脫蠟:石蠟切片在乙醇、甲醛中脫蠟。

  • 蛋白k孵育

  • 原位雜交

  • 雜交后處理

  • 雜交后顯色


具體實驗操作步驟
1、脫蠟:
1)二甲苯脫蠟3次,每次5min;
2)100%酒精兩次,每次2min;
3)移出酒精,斜置切片,標記末段向下,空氣干燥。
2、蛋白酶處理:
1)每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中預熱。將消化酶液加入管內,搖動直到酶溶解。
2) 37℃水浴槽中預熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3) ×SSC在室溫下漂洗切片3次,每次1min。
4)梯度酒精脫水(-20℃預冷)。
3、變性:
1)每一個立式染色缸配制40ml變性溶液;
2)78℃水浴槽中平衡預熱混合液染色缸;
3)78℃孵育8min;
4) 即移入-20℃預冷70%酒精的染色缸內2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃預冷酒精內,每缸2min;
5)空氣干燥。
4、雜交:
1)準備探針;
2)取一個較大的濕盒,交叉放置切片;
3)滴10μl探針在切片的組織上,加蓋玻片;
4)蓋上濕盒蓋,37℃孵育12h~16h。
雜交后的水洗:
5)鑷子小心去除蓋玻片;
6)43℃預熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
7)2×SSC(37℃)洗兩次,每次10min;
8)切片放人染色缸的1×PBS內待檢測,勿使切片干燥。
檢測:
9)從1×PBS中取出切片,除去過多的水分,避免標本干燥。把切片放入濕盒內,同時處理4張切片。
10)每張切片使用30μl~60μl羅丹明抗-抗體或FITC卵白素,室溫下孵育20min;
11)去掉塑料蓋膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
擴增:
12)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
13)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
14)去掉塑料蓋膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min;
15)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
16)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
17)1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
5、細胞核染色:
1)張切片加10μl~20μl DAPI,覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5ml;
2)盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內可以在顯微鏡下觀察。


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